W ciągu ostatnich trzydziestu lat rozmnażanie roślin metodą kultur tkankowych stało się jedną z najważniejszych agrotechnologii na świecie. W latach 1986–1993 łączna produkcja roślin mnożonych w ten sposób wzrosła o 50%, a w 1997 roku osiągnęła liczbę 800 mln roślin. W latach 1990–94 przemysł mikrorozmnażania rozkwitał w krajach rozwijających się (np. Indie), ale z powodu wysokich wymagań co do jakości roślin, znowu wzrosła produkcja in vitro w Europie. Od 1995 do dziś produkcja w krajach azjatyckich zwiększyła się o 14%, głównie z powodu wejścia na ten rynek Chin.
Po okresie rozkwitu w latach 80. ubiegłego wieku nastąpił na początku lat 90. przejściowy spadek liczby laboratoriów kultur tkankowych na świecie, obecnie notuje się ponownie powolny jej wzrost. O skali badań i produkcji roślin tą metodą może świadczyć liczba gatunków i odmian roślin, które rozmnaża się w 505 laboratoriach 23 krajów europejskich. W 1996 roku było to 1966 taksonów. Wśród roślin sadowniczych na pierwszym miejscu znajdowały się te z rodzaju Prunus (fot. 1), a w dalszej kolejności — według częstości występowania w laboratoriach naukowych i komercyjnych — Malus sp., Fragaria sp., Rubus sp., Vitis sp., Pyrus sp., Actinidia sp., Vaccinium sp. (czyt. też "Szkółkarstwo 2/2004 — red.).
Fot. 1. 'GiSelA 5′ rozmnożona in vitro
Kosztowna technologia
Mikrorozmnażanie jest technologią droższą niż tradycyjne metody. Głównymi tego przyczynami są wyższe koszty produkcji oraz wiedzy praktycznej (know-how). Początkowo istniały trudności ze sprzedażą materiału otrzymanego metodą kultur tkankowych, z powodu niższych cen materiału rozmnażanego tradycyjnie. Obecnie problem ten jest rozwiązywany poprzez poszukiwanie niezawodnych i wydajnych sposobów mikrorozmnażania. Wymaga to jednak stałego monitorowania kosztów odczynników, mediów, energii, robocizny i kapitału. W wysoko rozwiniętych krajach robocizna jest głównym czynnikiem wzrostu kosztów produkcji. Aby obniżyć te nakłady, można częściowo zmechanizować poszczególne etapy produkcji, np. wprowadzić pompy do rozlewania pożywki i maszyny do mycia naczyń, pojemników.
W mniej rozwiniętych krajach Afryki, Azji, Ameryki Południowej, gdzie robocizna jest tania, np. koszt przygotowania pożywki (w tym odczynników, energii i robocizny) może stanowić 30–35% produkcji roślinnej.
Główne zastosowanie technologii kultur tkankowych polega na produkcji wysokiej jakości jednorodnego materiału roślinnego, który może być rozmnażany przez okrągły rok, niezależnie od pory roku i pogody, w warunkach wolnych od chorób. Mikrorozmnażanie odgrywa znaczną rolę w szybkim wprowadzaniu do produkcji rzadkich genotypów, w rozmnażaniu genotypów trudnych do rozmnożenia metodami tradycyjnymi i w międzynarodowej wymianie materiału roślinnego. Ma też duże znaczenie w rozmnażaniu materiału wolnego od wirusów (fot. 2) oraz w technologii krioprezerwacji, która umożliwia utrzymanie kolekcji genów w stanie zamrożonym przez dłuższy czas (opracowana została dla truskawki, winorośli, maliny, gruszy, jabłoni oraz roślin z rodzaju Prunus).
Fot. 2. Podkładka 'P 22′ — wolne od wirusów rośliny otrzymane metodą kultur tkankowych
Dalsze rozpowszechnienie tej technologii jest jednak uzależnione od wydajności tego procesu
i obniżenia kosztów produkcji. Potanienia produkcji szuka się w nowych technologiach, metodach i urządzeniach, np. dzięki wydłużeniu okresów między kolejnym „pasażami” (przenoszenie roślin z dotychczasowej pożywki na nową, połączone często z ich dzieleniem) lub poprzez ominięcie fazy wydłużania pędów i ukorzeniania in vitro na korzyść ukorzeniania ex vitro, czyli po wyjęciu z naczyń (system taki z powodzeniem został już opracowany m.in. dla borówki wysokiej — Vacccinium corymbosum), a także przez ukorzenianie pędów in vitro, ale z pominięciem kosztownych pożywek ukorzeniających dla gatunków łatwo się korzeniących (np. z rodzaju Rubus).
Na skalę produkcyjną
Meira Ziv z Universytetu w Jerozolimie podaje, że szansą na obniżenie kosztów produkcji in vitro jest rozszerzenie skali produkcji oraz automatyzacja. Ta ostatnia może być osiągnięta przez zastosowanie bioreaktorów, gdzie w płynnych kulturach są namnażane ogromne ilości roślin. O dużej wydajności metody może świadczyć fakt, że w ciągu 25–30 dni, w 2–5-litrowym bioreaktorze można uzyskać 3–5-krotne namnożenie biomasy roślinnej. Rośliny uzyskuje się z organogenicznych kępek, które pochodzą ze zwartych, skupionych pąków lub merystemów. Kępki rozdziela się następnie za pomocą zestawu nożyc, przenosi na zestalone agarem pożywki w celu pobudzenia wzrostu. Otrzymane w ten sposób rośliny są przenoszone do warunków ex vitro.
Komercyjne rozmnażanie in vitro najczęściej polega na pobudzeniu pąków bocznych, znajdujących się w kątach liści lub pędów, i rozmnożenie pędów z pąków bocznych na pożywkach zestalonych agarem. W ten sposób z każdego pąka, w ciągu kilku tygodni, formowane jest skupienie pędów. Następnie nowo wytworzone pędy są oddzielane od pędu macierzystego, a przeniesione na świeże pożywki wydają kolejne pokolenie pędów. Metoda ta przypomina tradycyjny sposób rozmnażania przez sadzonki. Genetyczną stabilność rozmnażanego materiału można uzyskać poprzez pobudzanie do wzrostu i proliferację pędów bocznych otrzymanych z merystemów. Metoda ta jest możliwa do zastosowania dla większości gatunków roślin.
Założenie i utrzymanie stabilnej kultury to zajęcie czasochłonne i na wczesnych etapach produkcji notuje się duże straty z powodu zakażeń bakteryjnych lub zamierania kultury. Jednak w odpowiednich warunkach, po uzyskaniu stabilizacji kultury, z jednego pąka udaje się uzyskać w ciągu 2 miesięcy pęd z 5 lub więcej węzłami, które można oddzielać i zakładać z nich kolejne kultury. W ten sposób uzyskuje się współczynnik namnożenia 56, czyli 15 625 sztuk pędów w ciągu 12 miesięcy. Przy innym typie rozmnażania, polegającym na założeniu kultury z fragmentów pędów, pędy boczne produkowane są z kątów bocznych, a te z kolei wytwarzają następne. W tym przypadku można uzyskać 10 nowych pąków w ciągu 2 miesięcy, co daje 106, czyli 1 000 000 pąków w ciągu 12 miesięcy. Przy żadnym ze znanych tradycyjnych sposobów wegetatywnego mnożenia nie otrzymuje się tak intensywnego namnożenia w tak krótkim czasie, niezależnie od warunków pogodowych.
Rosnące zapotrzebowanie
Przy stałej tendencji do zastępowania podkładek generatywnych wegetatywnymi i okresowej wymiany materiału na zdrowszy, będzie wzrastała potrzeba szybkiego namnożenia zdrowego materiału szkółkarskiego (w przypadku podkładek), materiału do zakładania mateczników truskawki lub otrzymywania zdrowego materiału do zakładania plantacji bardziej lub mniej znanych krzewów owocowych. Otrzymane rośliny są wolne od większości lub nawet wszystkich endogennych (wewnętrznych) patogenów, dlatego lepiej rosną i rozwijają się po posadzeniu do gleby aniżeli rośliny rozmnażane tradycyjnymi metodami. Procent przeżycia roślin pochodzących z kultur in vitro wynosi w szkółce 80–90%.
Kultury tkankowe są prowadzone w warunkach higienicznych, międzynarodowy transport roślin otrzymanych tą drogą jest rzadko ograniczany, a ponadto zajmują one mało miejsca i są lekkie. Masa jednej rośliny jest tak mała, że jednokilogramowe opakowanie może zawierać około 500 sztuk roślin pochodzących z kultur in vitro.
Umowny średni koszt produkcji rośliny w kulturach tkankowych wynosi 0,25$, a nawet sięga wysokości 1$ w przypadku banana (chociaż np. w Nepalu – 0,19$). Rośliny truskawki z in vitro kosztują 0,5$ za sztukę.
Optymalne rozwiązania
Coraz więcej gatunków roślin — w tym wiele o dużym znaczeniu gospodarczym — jest rozmnażanych na skalę komercyjną właśnie metodą kultur tkankowych, m.in. trzcina cukrowa, migdałowiec, banan, cytrusy, palma daktylowa, kawa, ananas, eukaliptus, bambus, ziemniak, czosnek, winorośl, brzoskwinia, truskawka, róża.
O znaczeniu i rozmiarach produkcji materiału szkółkarskiego metodą mikrorozmnażania może świadczyć istnienie wielu dużych laboratoriów in vitro, m.in. Vitroplant (Cesena — Włochy), należące do grupy Fruttadoro-Orogel. W laboratorium tym produkowane są podkładki dla aktinidii, moreli, jabłoni, orzecha włoskiego, gruszy, brzoskwini, śliw, winorośli, a także własnokorzeniowe odmiany aktinidii, brzoskwiń. O rosnącym potencjale laboratorium może świadczyć fakt, że roczna produkcja roślin — wynosząca obecnie 7 mln sztuk — może zostać w najbliższym czasie podwojona.
Wiele jest korzystnych efektów rozmnażania in vitro, na przykład duża zdrowotność otrzymywanego materiału (truskawki, winorośl), znaczne obniżenie kosztów założenia plantacji przy użyciu roślin pochodzących z in vitro (borówka brusznica), ominięcie trudności przy rozmnażaniu metodami tradycyjnymi (borówka wysoka), czy też możliwość ocalenia gatunków rzadkich lub ginących (malina moroszka — podlega ścisłej ochronie).
Truskawki otrzymane metodą in vitro (fot. 3) przeznacza się do zakładania plantacji matecznych, z których pozyskuje się sadzonki, w stopniu elity i oryginału, dzięki takim cechom materiału wyjściowego, jak zwiększony wigor i wzrost juwenilny. Polecane są zwłaszcza do produkcji sadzonek na rozłogach w 1. i 2. roku, metoda taka powoduje obniżenie kosztów produkcji, ponieważ mateczniki z roślin in vitro wytwarzają o 60% więcej rozłogów i sadzonek w porównaniu z tradycyjnymi. W stopniu elity V1 współczynnik otrzymania roślin z rozłogów (w odniesieniu do rośliny matecznej) wynosi 1 : 50–100*, w stopniu oryginału V2 — 1 : 50–80. Zwiększona produkcja rozłogów i sadzonek może być wykorzystana do mikrorozmnażania odmian truskawek powtarzających owocowanie, które cechuje niska wydajność szkółkarska.
Fot. 3. Truskawki rozmnażane in vitro przeznacza się do zakładania plantacji matecznych
Borówka wysoka od dłuższego czasu z powodzeniem rozmnażana jest w warunkach in vitro, a uzyskany tą metodą materiał szkółkarski — używany do zakładania plantacji towarowych. Już w pierwszym roku prowadzenia szkółki krzewy pochodzące z kultur tkankowych kwitną, a w następnym można uzyskać pierwsze owocowanie. Cykl produkcji in vitro, od momentu założenia kultury do chwili sprzedaży gotowych roślin, wynosi około 15 miesięcy. Co 18 miesięcy powinno się odnowić kulturę. Przyjmuje się, że etap inicjacji kultur kończy się po uzyskaniu mniej więcej 1000 roślin z odmiany. Z niektórych odmian łatwo jest otrzymać czyste kultury (’Bluecrop’, 'Jersey’, 'Patriot’, 'Herbert’, 'Brigitta’), z innych nieco trudniej (’Toro’, 'Nelson’, 'Darrow’). Przy średnim współczynniku rozmnożenia 1,6 sztuk pędów można z 1 m2 fitotronu uzyskać w okresie 2 miesięcy około 10 000 pędów do ukorzeniania. Ukorzenienie tak dużej liczby pędów w kolbkach szklanych lub innych podobnych naczyniach wymaga zaledwie 5 m2 powierzchni. Duży procent ukorzenienia się roślin (99,4%) i wysoki stopień przeżycia roślin po przeniesieniu do szklarni (92,1%) gwarantują opłacalność tej technologii.
Borówka brusznica rozmnażana jest tradycyjnie przez nasiona, sadzonki, rozłogi. Rośliny otrzymane z sadzonek rzadko wytwarzają kłącza i nie tworzą produktywnych zadarnionych rzędów, dlatego konieczna jest częsta wymiana roślin na całych plantacjach towarowych. Kultury tkankowe umożliwiają szybkie uzyskanie dużej liczby roślin, które w okresie dochodzenia do dojrzałości przeżywają w wysokim procencie. O wartości roślin borówki brusznicy otrzymanych metodą kultur sterylnych świadczą obliczenia przeprowadzone w USA czy w Kanadzie. Wykonane zostały dla 2 ha gospodarstwa z uwzględnieniem wszystkich kosztów (materiałów, maszyn, robocizny) ponoszonych od założenia plantacji przez 9 lat. Zaopatrując się w sadzonki borówki brusznicy z mikrorozmnażania koszt roślin potrzebnych do założenia plantacji obniżono o połowę. W drugim roku prowadzenia plantacji odnotowano obniżkę kosztów o 38% w porównaniu z plantacją z roślin otrzymanych tradycyjnie. Przy obliczeniach dla odmian średnio plonujących zwrot poniesionych kosztów przy końcu 9. roku był o 17% wyższy niż przy stosowaniu roślin z tradycyjnego rozmnażania. Natomiast czysty zysk przy końcu 9. roku, po 7 latach plonowania, był w przypadku roślin z mikrorozmnażania o 6% większy niż przy roślinach z tradycyjnego rozmnażania, przy ustalonej jednakowej cenie detalicznej owoców.
Winorośl. Polowe obserwacje roślin otrzymanych metodą kultur tkankowych wykazują pewne zmiany fenotypowe w porównaniu z roślinami w tym samym wieku, ale rozmnażanymi tradycyjnie. Liście różnią się kształtem i owłosieniem, pędy i liście są bardziej czerwone, grona mniejsze, płodność jest obniżona, a w konsekwencji produkcja owoców opóźniona przynajmniej o jeden rok. Zmiany te zanikają sukcesywnie wraz z wiekiem. Przy rozmnażaniu techniką mikrocięcia obniża się ryzyko genetycznej zmienności.
Malina moroszka to relikt polodowcowy o ograniczonym współcześnie zasięgu, uprawiana jest m.in. w Norwegii. Podejmuje się próby rozmnożenia i wprowadzenia roślin tego gatunku do naturalnego środowiska. Jedną z metod szybkiego rozmnożenia jest wykorzystanie w tym celu kultur sterylnych. Pędy maliny moroszki łatwo proliferują, jednak ich ukorzenianie jest na etapie opracowywania.
* roślina mateczna : potomstwo
