Bez problemu można rozróżnić między sobą rodzaje – nikt nie pomyli pomidora z ogórkiem, ale już na poziomie odmiany sprawa nie jest taka oczywista. Szczególnie jeżeli trzeba zweryfikować rośliny w fazie siewki lub sadzonki, zanim jeszcze dojdzie do pełnej ekspresji ich swoistych cech odmianowych.
Marker, czyli znacznik
Każda odmiana rośliny charakteryzuje się szczególnymi cechami, które sprawiają, że jest ona odrębna od innych. Te cechy to jej swoiste znaczniki, czyli markery, które można rozpatrywać na kilku poziomach.
Najłatwiej zaobserwować markery morfologiczne, czyli cechy związane z wyglądem. Są to np. kształt i barwa liści, siła wzrostu, barwa kwiatów, wielkość, kształt i barwa owoców. Niestety, odmiany mogą być do siebie łudząco podobne w fazie sadzonki (fot. 1) lub siewki, zanim pojawią się owoce czy kwiaty. Cechy morfologiczne podlegają wpływowi warunków środowiskowych, jako przykład można podać zróżnicowane wybarwianie się kwiatostanów chryzantem w zależności od terminu kwitnienia (fot. 2). To sprawia, że nie zawsze możemy polegać na markerach morfologicznych.
Fot. 2. Mikrorozmnażanie często prowadzi do powstawania zmienności wśród produkowanych in vitro roślin. Dzięki markerom molekularnym można wykryć mutacje już na etapie sadzonki
Żeby zaobserwować kolejny rodzaj specyficznych znaczników, trzeba zagłębić się w strukturę komórki. Markery cytologiczne opierają się na liczbie i kształcie chromosomów, zawartości DNA w komórkach czy liczbie chloroplastów w komórkach aparatów szparkowych. Ten rodzaj markerów nie jest dostępny dla większości praktyków-ogrodników. Podobnie jest z markerami białek strukturalnych i enzymatycznych. Znaczniki cytologiczne i enzymatyczne nie dają także wysokiej „rozdzielczości” wyników, to znaczy, że nie dają gwarancji poprawnego rozróżnienia między roślinami.
Tymczasem zarówno cechy morfologiczne, cytologiczne, jak i biochemiczne są wynikiem ekspresji informacji genetycznej zapisanej w postaci kodu DNA w jądrze komórkowym. Właśnie do tego źródła, do tej podstawy stanowiącej o unikalności danego taksonu, sięgamy, wykorzystując markery molekularne bazujące na DNA.
Dla każdego i o każdej porze roku
We wszystkich żywych komórkach wegetatywnych rośliny, w jądrze komórkowym zawarta jest informacja genetyczna o budowie i funkcjonowaniu całego organizmu. Ważne jest to, że kod genetyczny jest taki sam we wszystkich komórkach i na każdym etapie rozwoju rośliny. Dlatego wystarczy fragment rośliny pobrany w dowolnym momencie jej rozwoju – w fazie siewki, sadzonki, a nawet nasiona. Jako źródło DNA do analizy można wykorzystać fragment liścia, korzenia, łodygi – dowolną część rośliny zawierającą tkanki wegetatywne. Kod genetyczny nie zmienia się pod wpływem warunków środowiskowych (choć zmienia się ekspresja cech przez niego kodowanych), zatem dla odczytu markerów molekularnych nie mają znaczenia warunki, w jakich rosły rośliny.
Oczywiście, żeby uzyskać dostęp do markerów molekularnych, potrzebne jest odpowiednio wyposażone laboratorium, odczynniki do biologii molekularnej, wiedza i doświadczenie w interpretacji wyników. Obecnie jednak, dzięki znacznemu obniżeniu kosztów prowadzenia analiz molekularnych, w tym obniżającym się wciąż cenom odczynników i udoskonaleniu, a także uproszczeniu metodyki, analiza markerów molekularnych jest dostępna dla szerokiego grona odbiorców. Zbliżamy się do momentu, kiedy wystarczać będzie wysłanie pocztą odpowiednio zabezpieczonej próbki roślin do laboratorium, żeby możliwe było dokładne ich oznaczenie za pomocą markerów molekularnych.
W ogrodnictwie najbardziej przydatne są markery molekularne opierające się na powielaniu (amplifikacji) DNA. Genialną w swojej prostocie i docenioną nagrodą Nobla reakcję łańcuchowej polimeryzacji DNA, czyli PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), przeprowadził w latach osiemdziesiątych Amerykanin Kary Mullis. Dzięki zastosowaniu wyjątkowego enzymu, termostabilnej polimerazy Taq, możliwe jest w stosunkowo krótkim czasie skopiowanie milionów egzemplarzy określonego fragmentu DNA. Polimeraza Taq pochodzi z termofilnych bakterii zasiedlających gorące źródła i prowadzi syntezę DNA w wysokiej temperaturze.
W urządzeniu zwanym termocyklerem (fot. 3), pozwalającym na szybkie, cykliczne zmiany temperatury, w obecności polimerazy Taq i składników DNA – nukleotydów, na matrycy DNA wyizolowanego z dostarczonej próbki tkanki roślinnej, powielane są fragmenty DNA. Jakie są to fragmenty, uzależnione jest od specyficznych starterów, czyli krótkich, specjalnie zaprojektowanych odcinków DNA wyznaczających miejsca rozpoczęcia procesu amplifikacji.
Fot. 3. Amplifikację DNA pochodzącego z badanej rośliny przeprowadza się w termocyklerze, czyli urządzeniu pozwalającym na precyzyjne i szybkie zmiany temperatury…
… Reakcję PCR prowadzi się w specjalnych probówkach w bardzo małej objętości, np. w 25 mikrolitrach mieszaniny reakcyjnej
Zmiany temperatury mieszaniny reakcyjnej i właściwości polimerazy Taq sprawiają, że cyklicznie zachodzą po sobie reakcje: rozdzielania badanej matrycy DNA, przyłączania starterow i amplifikacji.
Po upływie 2–3 godzin prowadzenia amplifikacji fragmentów DNA, rozdziela się uzyskane produkty na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym. Wykorzystuje się do tego zjawisko elektroforezy, podczas której obdarzone ładunkiem cząsteczki DNA przemieszczają się w żelu umieszczonym w polu elektrycznym. W zależności od swojej długości, fragmenty DNA migrują szybciej lub wolniej. Po elektroforezie uzyskuje się tzw. wzór prążkowy (fot. 4), który opisuje się za pomocą kodu zerojedynkowego (1 – prążek o danej długości jest obecny, 0 – brak prążka). Taki zerojedynkowy zapis dla kilku zastosowanych starterów prowadzi do stworzenia swoistego genetycznego „odcisku palca” (ang. fingerprinting) badanej próbki i pozwala stwierdzić, czy próbki różnią się między sobą, czy nie.
Fot. 4. Na podstawie wzorów prążkowych markerów molekularnych uzyskanych metodą RAPD, można stwierdzić, że w badanej grupie roślin są dwie odmiany. Każda ścieżka elektroforegramu pokazuje prążki uzyskane z DNA jednej rośliny. Skrajne ścieżki to wzorce długości fragmentów DNA
[NEW_PAGE]Markery molekularne noszą nazwy pochodzące od pierwszych liter angielskich słow. Dla celów związanych z produkcją i hodowlą roślin najczęściej wykorzystuje się markery bazujące na amplifikacji DNA, takie jak: RAPD, ISSR, SSR, STS czy SNP. Szczególnie chętnie stosowane są dwa pierwsze rodzaje markerów, gdyż są one bardzo łatwe do uzyskania oraz nie wymagają znajomości sekwencji DNA badanej próbki materiału roślinnego. W metodzie RAPD, czyli losowej amplifikacji polimorficznego DNA, wykorzystuje się krótkie, około dziesięcionukleotydowe startery, które przyłączają się w miejscach komplementarnych matrycy DNA badanej próbki. Natomiast metoda ISSR, czyli polimorfizm sekwencji międzymikrosatelitarnych, zakłada użycie dłuższych starterów odpowiadających motywom mikrosatelitarnym wraz z kilkoma nukleotydami selektywnymi.
Metoda ISSR uważana jest za bardziej powtarzalną niż RAPD, podejrzewa się też, iż markery mikrosatelitarne mogą być sprzężone z obszarami kodującymi na nici DNA.
Warto zaznaczyć, że amplifikowane w obu technikach fragmenty DNA nie kodują żadnych konkretnych genów. W materiale genetycznym żywych organizmów jest ogromna ilość DNA pozornie niemająca wielkiego znaczenia. Zróżnicowanie, czyli polimorfizm, właśnie w tych rejonach niekodujących jest najczęściej wykorzystywany do identyfikacji roślin metodami markerów molekularnych.
Zastosowanie
Dokładna identyfikacja materiału roślinnego (fot. 5) potrzebna jest, by dochodzić praw właścicieli do odmian chronionych. Markery molekularne dostarczają w krótkim czasie wiarygodnych dowodów, zarówno na potwierdzenie, jak i zaprzeczenie nieuprawnionego rozmnażania odmiany, niezależnie od etapu rozwoju rośliny czy pory roku. Dzięki markerom molekularnym można wskazać też, czy dana odmiana jest pochodną odmiany chronionej (np. jej mutantem), więc czy podlega ona ochronie na mocy decyzji dla odmiany matecznej.
Fot. 5. Po reakcji PCR rozdziela się fragmenty DNA z badanych próbek na żelu agarozowym podczas elektroforezy. Prążki DNA są wybarwione bromkiem etydyny i świecą w świetle UV. Do fotografowania, archiwizowania i wstępnej analizy uzyskanych wzorów prążkowych służy miniciemnia zaopatrzona w kamerę cyfrową i źródło światła UV, połączona z komputerem
Markery molekularne są także pomocne w wykrywaniu niepożądanej zmienności rozmnażanego materiału roślinnego. Dotyczy to szczególnie roślin rozmnażanych w warunkach in vitro, gdzie często dla zwiększenia współczynników mikrorozmnażania stosuje się pożywki z dużą zawartością regulatorów wzrostu, a to może ujemnie wpłynąć na wierność powielanych genotypów roślin. Dzięki markerom molekularnym można stwierdzić niestabilność genetyczną roślin rozmnażanych daną metodą, ewentualnie dopracować metodę oraz regularnie kontrolować produkowane rośliny. Markery molekularne pomogły udoskonalić metody mikrorozmnażania pod kątem zwiększenia stabilności genetycznej np. dla bananowców, ananasów, truskawek czy podkładek jabłoni.
Współczesna hodowla roślin również chętnie wykorzystuje markery molekularne. Przede wszystkim ułatwiają one dobór roślin rodzicielskich i wczesną identyfikację mieszańców w procesie krzyżowania. Dzięki markerom molekularnym możemy łatwo oznaczać linie homozygotyczne niezbędne w hodowli odmian heterozyjnych. Można także monitorować proces włączania nowego pożądanego materiału genetycznego do tworzonej odmiany, np. zawierającego geny odporności. Markery molekularne są pomocne w identyfikowaniu płci u roślin rozdzielnopłciowych, np. aktinidii czy szparaga. Mają także niebagatelne zastosowanie w kontroli procesów dziedziczenia cech ilościowych warunkowanych przez wiele genów, a mających szczególne znaczenie użytkowe, gdyż często związane są one z plonowaniem.
Laboratorium Genetycznego Identyfikowania Odmian i Badania ich Tożsamości
Pod koniec 2013 r. w ramach projektu „Realizacja II etapu Regionalnego Centrum Innowacyjności” prowadzonego w ramach Regionalnego Programu Operacyjnego Województwa Kujawsko-Pomorskiego na lata 2007–2013, współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego, na Wydziale Rolnictwa i Biotechnologii UT-P w Bydgoszczy, zostało utworzone Laboratorium Genetycznego Identyfikowania Odmian i Badania ich Tożsamości, wchodzące w skład Centrum Innowacji i Wdrożeń w Biotechnologii.
Wyposażenie laboratorium pozwala na analizę markerów molekularnych bazujących na amplifikacji DNA roślin metodami opisanymi powyżej. Zapraszamy hodowców oraz producentów do szerszego wykorzystywania markerów molekularnych w codziennej praktyce.
Dr inż. Natalia Miler
Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy
Fot. 1-5 N. Miler
Artykuł pochodzi z numeru 7/2014 „Hasła Ogrodniczego”
